摘要

结直肠癌（CRC）是全球癌症死亡率第二的常见疾病，尽管免疫检查点抑制剂（ICI）在许多癌症中展现了显著的疗效，但大多数CRC患者（尤其是微卫星稳定（MSS）型患者）对免疫治疗的反应却不理想。特别是大多数患者属于对免疫疗法“免疫耐受”的群体，这种现象引发了一个重大科学问题：为什么结直肠癌能够逃避免疫治疗的监视？

为了找出免疫治疗失败的原因，作者先搭建一个超大规模CRC单细胞整合图谱（4.27 million cells，1,670个样本），再用补充单细胞（含低mRNA细胞）、空间转录组、空间蛋白组把“位置、状态、功能”补齐；在此基础上，把患者分成四类免疫表型；进一步在髓系里提出“共识基因程序”，并锁定一个关键矛盾群体：既可能促瘤，也可能抗瘤的中性粒细胞。最后，作者用患者来源类器官（PDO）验证KRAS驱动的促瘤极化，并用原位小鼠模型证明肿瘤信号可在骨髓端提前重编程粒细胞生成，同时展示了可选择性清除促瘤型中性粒细胞的干预可能。

一、研究问题与核心假设：CRC中性粒细胞到底“站哪边”？它的空间组织与上游肿瘤信号是否决定了结局？

1）背景矛盾

CRC免疫微环境高度异质：同样叫“中性粒细胞浸润”，不同研究可能得出相反结论（促瘤/抑瘤）。这背后可能不是“谁对谁错”，而是：

• 中性粒细胞本身存在多状态谱系
• 它们在肿瘤中的空间位置（核心/边缘/侵袭前沿）不同，意义可能相反
• 肿瘤基因型（例如KRAS突变）可能在上游就把它们“重新编程”

2）核心科学问题

作者实际回答的是一个更“系统生物学”的问题：

能否通过跨队列单细胞整合 + 空间多模态，建立一个可复用的CRC免疫分型框架，并在其中识别中性粒细胞的促瘤/抗瘤亚型、空间生态位及其被肿瘤信号驱动的重编程路径？

3）核心假设

• CRC可以被稳定分成不同“免疫生态型”，且这种分型与预后/基因型相关
• 髓系细胞内部存在可跨数据集复现的“共识程序”，其中中性粒细胞包含促瘤型与抗瘤型（如抗原呈递样）
• 中性粒细胞在空间上形成“生态位”，并通过特定信号（如IL-1轴）与成纤维细胞等互作塑造耐受/抵抗环境
• 肿瘤还能在更上游的骨髓端诱导粒细胞生成改变，实现“先重编程、再输送到肿瘤”
• 若能选择性靶向促瘤型中性粒细胞或其关键互作轴，可能带来治疗窗口

二、研究设计总览：从“整合可靠性”到“机制可干预性”的证据链

1）平台可控性：先解决数据割裂，搭一个能站得住脚的CRC单细胞全景图谱。作者先用跨研究整合建立超大规模CRC单细胞图谱：4.27 million cells、1,670 patient samples，并进一步补充266名患者的单细胞数据（含低mRNA含量免疫细胞），再叠加3.7 million cells的空间转录信息与0.7 million cells的空间蛋白信息。这一步的目的就是把“能不能在不同队列/平台之间比较”这块地基先打牢，否则后续所有差异都可能被质疑为平台偏差。

2）分型可信度：在统一图谱上做免疫表型分层，让TME分类可复现。在上述图谱基础上，作者将肿瘤分成四类免疫生态型：immune desert、B cell enriched、T cell enriched、myeloid cell enriched，并强调这是由单细胞层面的TME细胞组成直接推导出来的分层框架。目的在于把“异质性”从噪声变成结构，让后续机制讨论不再是混在一起讲。

3）关键对象锁定：在髓系里提炼跨队列共识程序，把矛盾核心聚焦到中性粒细胞。作者在髓系细胞中用NMF提取“共识髓系基因表达程序”，其中包含四个免疫调控方向的程序，并且指出中性粒细胞程序本身富集炎症与TAN相关基因（如IL1A/IL1B、OLR1等），提示其功能多样性。在中性粒细胞内部的轨迹分析进一步显示：从血液进入组织后会分叉成两条轨迹——一条走向IL1A/IL1B高表达的促瘤样表型，另一条走向HLA-DRA高表达的抗原呈递样表型。

4）空间功能验证：不仅知道“有什么细胞”，还要知道“它们在一起干什么”。空间多模态单细胞分析显示肿瘤内存在中性粒细胞富集的功能性生态位（niche），并提出其与CAF之间可能通过IL-1信号发生关键互作：中性粒细胞表达IL1B，而IL1R1在成纤维细胞中特异表达，同时CAF/肿瘤细胞上调趋化因子（如CXCL5/CXCL3/CXCL1）可能通过CXCR1/2轴招募中性粒细胞。目的就是把“亚型”落到“组织结构与互作机制”，让机制从单细胞标签走向空间生态学解释。

5）机制必要性/可干预性验证：用PDO与原位小鼠模型回答“是谁在上游把它们推向促瘤”。功能层面，作者用患者来源类器官（PDO）相关实验给出“基因型→免疫表型”的证据，指出KRAS肿瘤信号可使中性粒细胞向促瘤方向极化。机制上推方面，原位小鼠模型显示肿瘤信号可影响骨髓端的中性粒细胞生成/表型，并支持“肿瘤诱导粒细胞生成（tumor-induced granulopoiesis）”的骨髓—血—肿瘤轴重编程。干预上，抗Ly6G处理呈现选择性耗竭Siglec-F+促瘤型中性粒细胞且总中性粒细胞数不变，并伴随TME更有利（如CD4+ PD-1+耗竭T细胞减少），从而把证据从“相关性”推进到“可操作靶点”。

三、主要结果：按证据链逐步回答关键问题

3.1 CRC单细胞图谱：把“能否比较”这件事先做成可推理的系统

作者把“整合—补洞—交叉验证”做成闭环：先整合76个CRC单细胞数据集形成超大规模图谱（4.27 million cells、650 patients、1,670 samples），再补充四个队列的单细胞数据（266名患者，并特别加强对低mRNA细胞（含中性粒细胞）的捕获），同时叠加空间单细胞转录（3.7 million cells）与空间蛋白（约0.7 million cells），让“位置”和“蛋白表型”成为对mRNA结论的外部支撑。

作者首先搭建了目前最全面的CRC单细胞资源：整合形成427万细胞、650名患者、1670份样本的图谱，并额外补充266名患者的低mRNA细胞捕获以及空间转录（370万细胞）+空间蛋白（约71.5万细胞）多模态数据，从源头上补齐了以往对中性粒细胞等低mRNA细胞捕获不足的结构性缺口。图谱覆盖正常—息肉—原发—转移—血液/淋巴等全阶段、多组织样本，为后续跨组织动态与TME推理提供“统一底盘”。

图1. CRC单细胞全景图谱

3.2免疫表型分层 + 髓系基因程序：把“异质性”从噪声变成结构

在统一图谱上，作者根据TME细胞组成将CRC分为四类免疫生态型：免疫荒漠（ID）/ T细胞优势（T）/ B细胞优势（B）/ 髓系优势（M），并观察到T细胞优势型与MSI概率升高等临床特征一致，说明分层具有生物学与临床一致性。

同时，作者用NMF在髓系细胞中提炼出“共识基因程序”，既区分身份程序（含中性粒细胞程序，富集IL1A/IL1B/OLR1等TAN相关基因），又提取免疫调控相关活性程序，为后续聚焦中性粒细胞“多功能性”埋下机制线索。

图2.四类免疫生态型与髓系共识程序

3.3基因型驱动的免疫表型：KRAS把中性粒细胞推向免疫抑制性TAN

为了从相关走向驱动，作者开发并应用Shears把单细胞图谱与TCGA等bulk队列对齐，显示：中性粒细胞富集与更差生存相关，并且KRAS突变肿瘤更偏向中性粒细胞浸润。

功能上，PDO/细胞系相关实验进一步证明：KRAS突变肿瘤信号可诱导健康供体中性粒细胞上调LOX-1（OLR1）、IL1A等TAN特征并呈免疫抑制效应，从而为“KRAS突变CRC免疫耐受”提供了机制解释。

图3. 从队列关联到功能因果

3.4中性粒细胞“二元亚型” + 空间生态位：位置决定意义，IL-1轴把其作用结构化

在中性粒细胞内部，作者识别出促瘤/抗瘤两条方向性轨迹：一条走向IL1A/IL1B高表达的促瘤型（TAN4），另一条走向HLA-DRA/HLA-DR高表达的抗原呈递型（TAN2/3）；并在蛋白层面验证HLA-DR在TAN更高。

更关键的是，预后分析提示其临床指向具有空间依赖：肿瘤核心区HLA-DR+中性粒细胞密度高与更好生存相关，而在侵袭边缘可能相反，强调“位置决定意义”。

空间多组学进一步把机制落到组织结构上：中性粒细胞在核心与边缘均呈簇状聚集，并形成neutrophil niche；该生态位中中性粒细胞高表达IL1B，CAF特异表达IL1R1并伴随CXCL趋化轴，提示“趋化招募—IL-1极化”的正反馈回路。

图4.中性粒细胞二元轨迹与位置依赖的预后指向

图5.neutrophil niche与IL-1介导的中性粒细胞-CAF互作

3.5“骨髓—血—肿瘤轴”闭环：肿瘤可远程诱导粒细胞生成，并出现可干预窗口

在AKPS原位模型中，作者观察到中性粒细胞浸润与系统性动员增强，并呈现从血→组织→肿瘤逐步活化的梯度；同时进一步在单细胞层面重建“骨髓—血液—结肠—肿瘤”轴轨迹，支持肿瘤诱导的granulopoiesis/骨髓端重编程：肿瘤信号可使骨髓祖细胞提前呈现成熟化/促瘤偏向。

干预上，抗Ly6G并非简单清空所有中性粒细胞，而是呈现对Siglec-F+促瘤型中性粒细胞的选择性削弱，同时降低CD4+PD-1+耗竭T细胞比例，提示存在更精细的干预可能。

图6.原位模型中的系统性动员与渐进活化

四、创新点剖析

1）构建“可推理”的全球最大CRC单细胞-空间多模态图谱，并补齐中性粒细胞长期缺席的技术短板。整合形成427万细胞、1,670个样本的CRC图谱，并通过优化策略高效捕获低mRNA含量的中性粒细胞，使其首次能够在全景尺度上被系统解析。

2）首次在CRC中建立“中性粒细胞双轨亚型—临床结局—空间位点”的闭环证据链。明确两条方向性亚型：HLA-DR/HLA-DRA高表达的抗原呈递样中性粒细胞与IL1A/IL1B高表达的促瘤样中性粒细胞，并提示前者在肿瘤核心区与更好生存相关，强调“位置决定意义”。

3）把机制从“肿瘤局部现象”上推到“基因型驱动+空间生态位+骨髓远程重编程”，并给出可干预线索。功能上用PDO相关实验支持KRAS信号推动中性粒细胞向免疫抑制/促瘤表型极化，空间多组学定义IL-1介导的中性粒细胞-成纤维细胞生态位，并在小鼠原位模型中证明肿瘤可远程诱导骨髓端粒细胞生成重编程（tumor-induced granulopoiesis），同时干预显示促瘤亚群可被选择性影响。

五、局限性与展望

局限性

1）“关联→必要性”在部分链条上仍未完全闭合：例如IL-1轴的空间互作提示非常强，但离“在体内必要性证明/干预获益”仍有距离。

2）空间多模态虽然覆盖大，但仍受样本数量与分辨率边界限制：生态位机制的普适性需要更大规模、多中心验证。

3）中性粒细胞作为短寿命细胞，其状态可塑性极高：不同治疗背景、不同时间点的动态变化可能比静态图谱更关键。

展望

后续可进一步锁定促瘤型与抗原呈递型中性粒细胞的关键分子开关，并将免疫生态分型与KRAS等基因型联合用于临床分层；同时验证能否在肿瘤外周端干预骨髓粒细胞生成重编程，从源头减少促瘤型输入；并把空间生态位机制与疗效/耐药直接对接，评估其对新辅助或免疫治疗反应的预测价值。