摘要

为什么同一个人的肿瘤，原发灶和转移灶对治疗的反应截然不同？ 这是肿瘤学领域长期未解的核心谜题之一。黑色素瘤作为免疫治疗响应率较高的实体瘤，一旦发生淋巴结转移，患者预后仍显著恶化，这种现象引发了一个重大科学问题：淋巴结微环境如何重塑肿瘤细胞的治疗响应模式？

为了回答这一问题，作者先通过连续9代的体内筛选构建了高度倾向淋巴结转移的黑色素瘤细胞系模型，再用转录组学、代谢组学、蛋白组学把“基因—代谢—蛋白”三个层面的变化补齐；在此基础上，锁定铁死亡防御通路发生了最显著的重塑；进一步在机制层面聚焦低氧这一核心环境因子，揭示其通过泛素-蛋白酶体途径促进GPX4降解，同时诱导FSP1表达升高及溶酶体定位重塑。最后，作者用原位淋巴结肿瘤模型验证FSP1抑制剂的疗效，并用基因敲除小鼠证明其作用特异性，同时通过皮下与淋巴结的对比实验展示了FSP1靶向效应的微环境依赖性。一、研究问题与核心假设：为什么淋巴结环境会重塑肿瘤细胞的铁死亡防御？

1）背景矛盾

铁死亡（Ferroptosis） 是近年来备受关注的细胞死亡方式。肿瘤细胞演化出多套抗氧化防御系统来应对铁死亡压力，其中两条重要防线包括：

• GPX4防线：需要谷胱甘肽（GSH） 作为辅因子来中和脂质过氧化物，其功能与谷氨酸-半胱氨酸连接酶（GCLC） 介导的GSH合成密切相关；
• FSP1防线：以不依赖GSH的方式，通过还原辅酶Q10来抑制脂质过氧化，与GPX4协同或互补发挥作用。

过去研究发现，黑色素瘤细胞在血液中转移时对GPX4有较强依赖性；但在淋巴系统转移的背景下，这种依赖性发生了变化。这就引出一个核心问题：进入淋巴结的肿瘤细胞，其铁死亡防御机制是否被微环境“重塑”？

2）核心科学问题

本研究旨在探索：

• 淋巴结微环境如何“重塑”黑色素瘤细胞对GPX4和FSP1这两条防线的依赖性？
• 这种重塑背后的分子机制是什么？
• 能否利用这种重塑开辟新的治疗策略？

3）核心假设

• 淋巴结微环境（特别是低氧条件）可能诱导肿瘤细胞的代谢和抗氧化防御重塑；
• 这种重塑可能导致细胞对GPX4的依赖性降低，同时对FSP1的依赖性增强；
•  这种依赖性的转变，可能使FSP1成为在淋巴结这一特定微环境中值得关注的潜在靶点。

二、研究设计总览：从“临床谜题”到“微环境靶向”的证据链

1）平台可控性：先建立一个能站得住脚的淋巴结转移研究模型。 作者通过在小鼠体内进行连续9代的淋巴结转移灶筛选，成功获得了一系列淋巴结转移倾向增强的黑色素瘤细胞系（简称LN系），并以亲本系作为对照。这一步的目的就是把“能不能研究淋巴结定植过程中的适应性变化”这块地基先打牢—有了这个稳定、可比的模型平台，后续所有差异分析才能更可靠地归因于淋巴结定植本身，而非细胞系之间的随机偏差。

2）全景扫描：在全局层面锁定铁死亡防御轴的关键变化。 在上述模型基础上，作者对亲本系和不同世代的LN系进行转录组、蛋白组和代谢组联合分析，全景扫描所有与细胞死亡相关的通路。目的在于把“异质性”从噪声变成信号，让后续机制讨论不再是无的放矢，而是有明确的聚焦方向。结果清晰指向：在众多死亡通路中，铁死亡通路发生了最显著的重塑—这为后续研究把矛盾核心聚焦到铁死亡防御机制提供了明确方向。

3）环境因果验证：区分“克隆选择”与“环境诱导”。 观察到的变化，是细胞在长期筛选中被“选”出来的罕见克隆，还是被微环境直接“诱导”出的适应性改变？为回答这一关键问题，作者将同源肿瘤细胞分别植入皮下（模拟原发灶）和淋巴结内（模拟转移灶）。这一步的设计逻辑在于：如果仅改变环境就能重现长期筛选得到的特征，那就证明是环境在“诱导”这些改变，而非克隆筛选的结果。实验结果证实了后一种可能，从而把研究从“相关性描述”推向“因果指向”。

4）机制深潜：锁定低氧为重塑的关键驱动因子。 淋巴结环境复杂多样，哪个具体因素是重塑的“幕后推手”？作者敏锐地抓住低氧这一核心特征—淋巴结是体内典型的“低氧区”，氧气浓度常低至1%-3%。通过在体外精确控制氧气浓度（1% O₂模拟淋巴结低氧），他们系统研究了低氧对铁死亡防御机制的调控作用。目的就是把“环境”这个笼统的概念拆解为可实验操作的具体变量，揭示从“环境信号→蛋白降解→功能重塑”的分子链条。

5）体内干预验证：检验FSP1靶向的微环境特异性和可干预性。 在明确了低氧诱导的重塑机制后，作者进一步追问：这种重塑出的依赖性能否转化为治疗机会？它是否真的具有“换个位置就失效”的微环境特异性？为此，他们分别在淋巴结原位肿瘤模型和皮下肿瘤模型中测试FSP1抑制剂的疗效，并用Fsp1基因敲除细胞验证作用的特异性。这一步的目的就是把证据从“机制相关性”推进到“可干预靶点”和“位置依赖性”的临床前验证，完成整个研究链条的闭环。

三、主要结果：按证据链逐步回答关键问题

3.1 模型构建与全景扫描：从“淋巴结转移模型”到“铁死亡防御重塑”的发现

作者把“筛选—建系—多组学解析”做成闭环：先通过在小鼠体内进行连续9代的淋巴结转移灶筛选，成功获得了从第1代到第9代的一系列LN转移细胞系（LN1–LN9），并以亲本系（B16-F0）作为对照。这一步的目的在于建立一个淋巴结转移倾向明确、与亲本可比的研究模型—晚代细胞系（LN7、LN8、LN9）表现出较高的淋巴结转移倾向，而亲本系则相对较低，为后续跨世代比较分析奠定了可靠的模型基础。

在这一模型基础上，作者对亲本系、早代系（LN1）和晚代系（LN7-9）进行转录组、蛋白组和代谢组联合分析，全景扫描所有与细胞死亡相关的通路。目的在于把“异质性”从噪声变成信号，让后续机制讨论不再是无的放矢，而是有明确的聚焦方向。多组学分析结果显示：

1)转录组层面：在所有死亡通路中，铁死亡通路相关基因变化最为突出。其中，Gclc（谷胱甘肽合成关键酶）的mRNA水平随传代次数增加呈下降趋势，而 Fsp1的mRNA水平呈上升趋势。

2)蛋白层面：晚代LN系中GCLC水平降低、FSP1水平升高，同时GPX4和ACSL4的蛋白水平也观察到降低，证实铁死亡防御机制发生了系统性重塑。

3)临床相关性验证：通过组织芯片检测包含原发性黑色素瘤和淋巴结转移灶的临床样本，观察到淋巴结转移灶中FSP1与GCLC/GPX4的表达呈现一定的负相关趋势，与小鼠模型的观察结果一致，提示这一发现具有临床转化潜力。图1. 连续淋巴结筛选模型及铁死亡相关蛋白的表达变化

3.2 环境因素验证：是细胞自己进化了，还是环境“重塑”了它们？

上述发现提出了一个关键问题：这些变化是细胞内在特性的改变，还是被微环境“重塑”的结果？为探索这一问题，作者将B16-F10黑色素瘤细胞分别注射到小鼠的皮下和淋巴结内。

通过检测缺氧标志物HIF-1α，他们证实淋巴结内肿瘤确实处于显著的缺氧状态（HIF-1α水平远高于皮下肿瘤）。更重要的是，这些仅在淋巴结内生长了几周的肿瘤细胞，也表现出了与长期筛选的LN系完全一致的特征：GCLC和GPX4蛋白水平显著下降。这强有力地证明：是淋巴结微环境本身“重塑”了这些蛋白的表达，而非罕见的耐药克隆被筛选出来。在Fsp1敲除细胞中，这一现象仍然存在，表明这种重塑不依赖于FSP1。 图2. 淋巴结微环境重塑GCLC和GPX4表达

3.3 机制深潜：低氧如何“重塑”铁死亡防御？

淋巴结环境千头万绪，哪个因素是重塑的关键？作者敏锐地抓住了低氧这一核心特征。淋巴结是体内典型的“低氧区”，氧气浓度常低至1%-3%。通过在体外精确控制氧气浓度（1% O₂模拟淋巴结），他们完整走通了从“环境信号→蛋白降解→功能重塑”的证据链条。

1）GPX4的降解机制（图3）：在1% O₂的低氧环境下，GPX4蛋白水平随时间延长逐渐下降，且这一过程可逆（复氧后迅速回升）。这种下降可被蛋白酶体抑制剂（硼替佐米、MG-132） 完全阻断，而自噬抑制剂或抗氧化剂无效。免疫共沉淀实验直接证明：低氧条件下GPX4蛋白的泛素化水平升高，证实其通过泛素-蛋白酶体途径被选择性降解。亚细胞分级分离显示，降解主要发生在细胞质中。图3. 低氧条件下GPX4通过泛素-蛋白酶体途径降解

2）代谢重塑与FSP1的亚细胞定位（图4）：

•  GSH代谢重塑：非靶向代谢组学显示，LN系的代谢谱与亲本系截然不同。与GSH合成相关的代谢物—谷氨酸、半胱氨酸、还原型和氧化型谷胱甘肽，水平均显著降低。发光法检测证实，LN系的GSH基础水平更低，且在缺乏半胱氨酸时下降更快，表明其GSH合成能力确实受损。
• FSP1的定位重塑：高分辨率共聚焦显微镜显示，在亲本系中FSP1散在分布于细胞质，但在LN系中FSP1显著富集于核周点状结构。通过多种细胞器marker共染色，确认这些结构是溶酶体（LAMP1阳性），而非内质网、高尔基体或线粒体。
• 定位机制：FSP1的膜定位依赖于豆蔻酰化修饰—使用豆蔻酰转移酶抑制剂IMP-1088，或构建无法被豆蔻酰化的FSP1 G2A突变体，均可破坏其溶酶体定位。溶酶体是铁死亡攻击的潜在靶点：当使用靶向溶酶体的铁死亡诱导剂（Fentomycin）处理时，Fsp1基因敲除的LN系细胞表现出更严重的脂质过氧化，证实了溶酶体FSP1的保护功能。

图4. LN系中GSH代谢重塑及FSP1的亚细胞定位重塑

3.4 体内干预验证：FSP1靶向的微环境特异性

尽管FSP1在LN系中扮演重要角色，但体外实验中FSP1抑制剂单用效果有限。然而，体内实验揭示了这种重塑带来的治疗机会：

1）人源细胞淋巴结模型验证：将人黑色素瘤细胞SK-MEL5注入免疫缺陷小鼠的淋巴结形成肿瘤后，局部给予FSP1抑制剂（viFSP1或FSEN1） 观察到肿瘤生长受抑制的趋势，以及生存期的延长。

2）靶点特异性验证：为进一步评估作用的特异性，作者将LN7系的Fsp1基因敲除后注射到小鼠淋巴结内。结果显示，Fsp1-KO肿瘤的生长速度相对较慢，提示FSP1本身是淋巴结微环境中肿瘤生长的重要依赖；给予viFSP1治疗对野生型肿瘤有抑制效果，但对Fsp1-KO肿瘤无明显影响，证实观察到的效应依赖于FSP1。

3）微环境特异性验证：将同样的细胞注射到皮下后，Fsp1基因敲除对肿瘤生长的影响不明显，viFSP1治疗的效果也相对较弱。这一对比强有力地提示：FSP1的依赖性和可靶向性，是淋巴结微环境“重塑”出的特征—同一个细胞，放在不同位置，对同一个靶点的依赖度天差地别。图5. FSP1靶向的微环境特异性：淋巴结微环境“重塑”出的治疗窗口

四、创新点剖析

1）首次揭示转移微环境对铁死亡防御机制的重塑作用。本研究关注了肿瘤细胞在不同微环境中的适应性变化，发现淋巴结定植过程伴随铁死亡防御相关基因表达的调整，为理解“转移与治疗反应”的关系提供了新的视角。

2）发现低氧条件下GPX4的调控机制及FSP1亚细胞定位的重塑特征。研究观察到低氧条件下GPX4可通过泛素-蛋白酶体途径被降解，同时淋巴结来源的细胞中FSP1表现出核周溶酶体区域的富集。这为进一步研究铁死亡防御机制的空间调控提供了线索。

3）提出并验证“微环境重塑的靶点依赖性”策略。本研究发现FSP1靶向的效应在淋巴结原位模型中相对更明显，而在皮下模型中效果有限。这一观察提示，肿瘤微环境对细胞特征的“重塑”可能影响靶向治疗的效果，在未来的治疗策略设计中值得考虑。

4）完美诠释了“临床现象-机制探索-体内验证”的研究闭环。从临床关注的淋巴结转移问题出发，通过精巧的体内模型和严谨的机制探索，最终回到原位治疗验证，并延伸到人类样本，形成了较为完整的研究链条。

五、局限性与展望

局限性

1）FSP1抑制剂在体外与体内效应差异的原因尚需进一步研究。这可能与体内微环境的复杂性、药物代谢动力学特征、或其他细胞群体的参与有关，值得后续深入探索。

2）FSP1在溶酶体区域的具体功能和作用机制有待阐明。其在该区域的精确作用、与其他分子的互作关系、以及对铁死亡调控的具体贡献，仍是未解的科学问题。

3）研究主要基于小鼠模型和有限的人源细胞系。虽然人组织芯片提供了初步的相关性证据，但FSP1靶向在人体中的疗效、安全性和最佳应用方式，仍需通过严格的临床试验进行评估。

4）从基础研究到临床应用的转化路径仍需探索。目前的研究为理解淋巴结转移的生物学提供了新视角，但其临床意义和转化价值需要在更接近真实临床环境的模型中进一步验证。

展望

未来的研究可考虑：在更贴近临床的模型系统中进一步验证FSP1靶向的潜力；探索不同转移器官的微环境特征及其对靶点依赖性的“重塑”作用，为个体化治疗策略提供更多依据；深入研究铁死亡调控网络的空间组织和动态变化，发掘新的干预靶点。此外，将基础研究发现与临床样本分析、转化研究有机结合，有望推动对肿瘤转移生物学的深入理解和治疗策略的创新。